（ヌクレアーゼ）

DNaseの場合、一本鎖を切断する酵素と、二本鎖を切断する酵素がある。

名称	起源	特異性	被切断鎖	切断様式
膵臓RNase RNase T1 S1 ヌクレアーゼ 蛇毒ヌクレアーゼ 脾臓ホスホジエステラーゼ スタフィロコッカスヌクレアーゼ マングマメヌクレアーゼ アカパンカビヌクレアーゼ RNase H RNase H 膵臓DNase I Bal 31 Exo I Exo III Exo VII l エキソヌクレアーゼ	ウシ コウジカビ A. oryzae C. atrox ウシ S. aureus マングマメ アカパンカビ 各種細胞 レトロウィルス ウシ A. espejiana 大腸菌 大腸菌 大腸菌 lファージ	RNA RNA RNA,DNA RNA,DNA DNA,RNA RNA,DNA DNA,RNA DNA,RNA RNA,DNA RNA,DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA	一本鎖 一本鎖 一本鎖 一本鎖 一本鎖 一本鎖 一本鎖 一本鎖 二本鎖 二本鎖 一本鎖,二本鎖 一本鎖 二本鎖 一本鎖 二本鎖 一本鎖 二本鎖	エンド(b型) エンド(b型) エンド(a型) エキソ(3'->5') エキソ(5'->3') エンド(b型) エンド(a型) エンド(a型) エンド(a型) エキソ(3'->5') エンド(a型) エンド(a型) エキソ(3'<->5') エキソ(3'->5') エキソ(3'->5') エキソ(3'<->5') エキソ(5'->3')

平衡密度勾配遠心分離

クロマトグラフィー

		[ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる１本鎖と 2本鎖DNAの分離]
吸光度を測定
[CsCl平衡密度勾配遠心法]

電気泳動

核酸の分離にはアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを担体とした電気泳動がよく利用される。核酸はリン酸基に起因する負の電荷をもつので、常に陽極に移動する。この時、短い断片ほど速く移動する。DNAの検出には臭化エチジウムが用いられる）。
　アガロースゲル電気泳動は約50kbが分離の限界である。非常に大きなDNAにはパルス電場(PEG)電気泳動が用いられる。これは、一定時間ごとに電場をかける方向を60〜90度変化させる方法で、アガロースゲル内で短いDNAほどrealignし易く、泳動速度が速いことを利用したものである。この方法で10,000kbまでのDNA断片が分離できる。

	２枚のガラス板の間にアクリル アミド溶液を入れ固まらせる。 上部にくし型プラスチック板を 入れておくと試料を入れるため の溝ができる。	上下にプラスチックの箱をセット し、中に泳動用の緩衝液を入 れる。試料を溝に添加し通電。 =>小さな分子ほどゲル の中を早く移動する
[アガロースゲル電気泳動(左)とポリアクリルアミドゲル電気泳動(右)]

[DNAの染色に用いられる臭化エチジウム(ethidium bromide)]
　DNAに結合すると蛍光を出す。

　プロッティング

電気泳動のゲル中で分離したDNAやRNA断片あるいはタンパク質をニトロセルロースなどの人工膜に写しとる操作をブロッティングという。

[ブロッティング装置]
【種々のブロッティング】 (a) サザン(Southern)ブロッティング 標識したmRNAやcDNAでDNA断片を検出する方法 (b) ノザン(Northern)ブロッティング 標識したcDNAdでmRNAを検出する方法 特定のmRNAの(i) 鎖長の解析、(ii) 組織分布、(iii)発現の有無や量の解析に利用される。 (c) ウェスタン(Western)ブロッティング 標識した抗体でタンパク質を検出する方法 ★標識法としては、放射能標識以外に蛍光標識がよく利用される。Westernブロッティングでは、酵素標識法や化学発光法も使われる。

　ハイブリダイゼーション

³²Pなどで放射性標識したcDNAやmRNAと2本鎖を形成するかどうかを調べる方法をハイブリダイゼーション（hybridization）という。このような目的に使われる標識物をプローブ(probe)といい、プローブが結合したDNAの位置はＸ線フィルムに感光させて検出できる（オートラジオグラフィー）。BAS-2000などのイメージングアナライザーで検出することもできる。

	[g-32P]ATP
	T4 ポリヌクレオチド キナーゼ
[DNAの5'末端の放射性標識法]
広範囲に標識するときはDNAポリメラーゼ I のニックトランスレーションを利用。

[ハイブリダイゼーション]

　化学的分解法（Maxam-Gilbert法）

（例）次の13残基のオリゴヌクレオチドの構造決定を行うこととする。

5' ATCGATTCTCGGA 3'

1) まず、このオリゴヌクレオチドの5'末端を³²Pや³³Pで放射標識する(●)。

5' ●-ATCGATTCTCGGA 3'

2) この試料溶液を4等分し、次の4種の化学分解を行う。

切断される塩基	G	G + A	C	C + T
反応液の組成	32Ｐ-DNA DMA緩衝液 ジメチル硫酸	32Ｐ-DNA 水 ギ酸	32Ｐ-DNA NaCl溶液 ヒドラジン	32Ｐ-DNA 水 ヒドラジン
反応条件	20℃,4.5分	20℃,10分	20℃,8分	20℃,8分

この条件では、特定の塩基のところでランダムに切断が起こり、反応液中に以下のような放射標識断片が生じる。（標識されていない断片もたくさんできるが，検出できないので考えなくてよい）

Ｇで分解		Ｃで分解
	●-ATC ●-ATCGATTCTC ●-ATCGATTCTCG		●-AT ●-ATCGATT ●-ATCGATTCT
Ｇ + Ａで分解		Ｃ + Ｔ で分解
	● ●-ATC ●-ATCG ●-ATCGATTCTC ●-ATCGATTCTCG ●-ATCGATTCTCGG		●-A ●-AT ●-ATCGA ●-ATCGAT ●-ATCGATT ●-ATCGATTC ●-ATCGATTCT

3) これら4つの試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。各々のＤＮＡ断片はサイズだけで分離される。
4) ゲルのオートラジオグラムを作成する（Ｘ線フィルムに露光すると、例の場合、図のようになるであろう。

[Maxam-Gilbert法によるＤＮＡ塩基配列の決定]     （オートラジオグラム）

5) 図の泳動先端（図の下端）のバンドから順に上にバンドの位置をたどっていくことで、目的DNA断片の5'→3'方向の配列を決定できる。（ただし、C+TとCの同じ位置にバンドがある場合はCとなり、C+TにはあるがCにバンドがない場合はTとなる。G+Aについても同様。）

ジデオキシ法（Sanger*法, 鎖終結法）
　　* インシュリンの1次構造決定でノーベル賞を受賞した人

　大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを用い、配列を決めたい1本鎖DNAの相補的コピーをつくる。この時、DNA合成に必要な4種のdNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)以外に、DNA阻害剤である2',3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を少量反応液に加える。ddNTP（terminatorという）が取り込まれると、DNA合成は停止する。反応の停止はランダムな位置で起こるので、鎖の長さの異なる様々な断片が得られ、あとは化学的分解法と同様な考え方で配列を決定する。

1) まず、配列を決めたい1本鎖DNAの3'末端に相補的な短いオリゴヌクレオチドをプライマーとして準備し、プライマーの5'末端を³³Pや³⁵Sで放射標識するか，または蛍光色素で標識する｡

5' CTGACTTCGACAA 3'		未知の塩基配列をもつ1本鎖DNA
3' GTT●	5'	5'標識プライマー

2) 配列を決めたい1本鎖DNA溶液を4等分し、標識プライマー、4種のdNTPを加える。これらにterminator（ddNTP）を1種ずつ加える。
3) DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを加えて複製を開始する。
        ->加えたddNTPのため、鎖伸長はランダムな位置で停止する。

DNAポリメラーゼI dATP dGTP dCTP dTTP
例えばddATPを少量加えた試験管の場合、上の配列では次の 3つの標識断片が生成する。下線はプライマー部分を表す。

ddAGCTGTT-● 5' ddAAGCTGTT-● 5' ddACTGAAGCTGTT-● 5'

4) これら4つの試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。各々のＤＮＡ断片はサイズだけで分離される。
5) ゲルのオートラジオグラムを作成する。

[Sanger法による塩基配列決定]

6) 図のように、泳動先端（下端）のバンドから順に上にバンドの位置を辿っていくことで、目的配列の相補鎖の5'→3'方向の配列を決定できる。
これを目的配列（鋳型鎖）に読み替えるには、読みとった配列をひっくり返せばよい。

蛍光標識法を用いる塩基配列決定の自動化

Sangerの原法では、実験ごとにプライマーをいちいち放射標識する必要があり、大変面倒である。波長の異なる蛍光発色団でterminatorを標識することにより、迅速で簡便な塩基配列決定法が開発された。

ddATP-● ddTTP-● ddGTP-● ddCTP-● 　波長の異なる４種の蛍光発色団 実際には、rhodamine系蛍光色素

[蛍光標識terminators]

≪蛍光標識法の手順≫

1. 先ず、配列を決めたい1本鎖DNA、プライマー、4種のdNTPを含む溶液に、波長の異なる蛍光色素で標識した4種のddNTP混合物（terminator）を加える。
2. DNAポリメラーゼで鎖を伸長させる。加えたterminatorによって、鎖伸長はランダムな位置で停止する。
3. 試料をゲル電気泳動にかける。
4. ゲルにレーザー光を当てて蛍光バンドを検出し、情報をイメージングシステムに転送する（図 8.11）。
5. 検出したバンドの情報をコンピューターで処理し、ピークとして表す。

[蛍光標識法による塩基配列決定]

　転写活性の測定法

転写活性を簡便に測定するには、プロモーターの下流に酵素遺伝子をリポーター遺伝子としてつなぎ、細胞に導入する。プロモーターが働くと酵素遺伝子が転写され、タンパク質（酵素）がつくられる。その酵素活性を測ることによって、間接的にRNA量、つまりプロモーター活性が見積もられる。
リポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Chloramphenicol AcetylTransferase、CAT）、b-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが用いられる。

転写制御因子などのＤＮＡ結合タンパク質の検出

1) ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析： electrophoretic mobility shift assay, EMSA）

タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動におけるDNAの移動度が低下することを利用した転写制御因子の検出法。³²Pで標識したDNA断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィーでDNAの位置を見ると、因子の結合したDNAはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。DNAのほんの一部に結合があっても検出でき、DNA結合反応の定量的解析ができる。

2) DNase I フットプリント法

　DNA分解酵素の一種であるDNase I (デオキシリボヌクレアーゼ�T）は裸のDNAを分解するが、タンパク質と結合したDNAは分解しない。この性質を利用して、転写制御因子が結合するDNAの領域を決定する方法である。一端を³²Pで標識したDNA断片と転写制御因子を混ぜ、少量のDNase Iを低温または短時間作用させて部分的にDNAを分解する。電気泳動とオートラジオグラフィーでDNAの断片を調べる。標識末端からのDNA長に従ってはしご状のバンドが見えるが、転写制御因子が結合した部分ではDNAが切れないために断片が生じず、はしご状のバンドの一部が足跡(footprint)のように抜ける。同じDNA断片をMaxam-Gilbert法で処理したものと比較することで、抜け落ちた領域が決定できる。

　in situ ハイブリッド形成法(in situ hybridization)

クローン化されたDNA断片の染色体上の位置を決める方法。標識DNA断片（プローブ）を、細胞分裂中期の染色体に直接ハイブリッド形成させ、染色体上の結合部位を標識によって可視化する。組織のmRNAの解析にも用いられる。蛍光標識プローブを用い、蛍光で検出する方法を fluorescence in situ hybridization (FISH)という。

	加熱処理 変性		ビオチン化した ＤＮＡプローブ ハイブリダイズ		蛍光標識した アビジン ビオチン化ＤＮＡ が結合した部位を
スライドガラス上の 二本鎖ＤＮＡ		一本鎖ＤＮＡ		標的配列に結合した プローブ（●）	視覚化する
		ヒト染色体セントロメアのサテライト ＤＮＡ ビオチン標識したＤＮＡプローブの 結合した位置に蛍光標識アビジンが 結合し、赤く対染色した染色体を 背景に，黄色の蛍光で観察できる｡
ビオチンーアビジンを 介して蛍光色素（●） が標的ＤＮＡに結合

　遺伝子歩行(gene walking)

目的遺伝子の近傍のDNAから出発して、重なり合うクローンを次々にクローン化（歩行）して目的遺伝子にたどり着く手法（。巨大な遺伝子の全領域のクローン化には無くてはならない方法である。染色体歩行(chromosome walking)やDNA歩行ともいう。

　ツーハイブリッド法

タンパク質間の相互作用を遺伝子（転写因子活性）で調べる方法。転写因子のDNA結合部位(DBD)と転写活性化部位（TAD）は別の分子上にあっても、それらが結合すれば転写因子活性が出ることを利用。レポーター遺伝子としてはb-ガラクトシダーゼ遺伝子がよく用いられる。